Cel badań
Celem projektu jest poznanie mechanizmu działania receptora kiełkowania GerA przetrwalników B. subtilis.
Metoda badawcza
Cel projektu pragniemy zrealizować wykorzystując metodologię genetyki molekularnej wspartą modelowaniem molekularnym. Warsztat genetyki molekularnej zostanie wykorzystany do przeanalizowanie wpływu tła genetycznego na powstające przetrwalniki a w szczególności na ilość i funkcjonowanie receptora GerA. Skonstruowane szczepy zostaną poddane analizie poziomu ekspresji badanego receptora za pomocą Quantitative Gene Expression on the MassARRAY® System firmy Sequenom oraz ilości podjednostek receptora Gera w przetrwalnikach za pomocą metody western blotting. Wytworzone przetrwalniki będą pobudzane do kiełkowania za pomocą germinantów pokarmowych (L‐ala, L‐val), nie‐pokarmowych (dodecyloamina) oraz metod fizycznych (ciśnienie). Uzyskane wyniki w szczepach posiadających wszystkie receptory kiełkowania jak lub wyłącznie GerA pozwolą na uzyskanie wyników niezbędnych do sformułowania odpowiedzi na postawione pytania. Za pomocą modelowania molekularnego zostanie zbudowany model receptora GerA. Pozwoli to na zidentyfikowanie rejonu wiązania substratu oraz miejsc kontaktu między podjednostkami receptora, które posłużą jako wytyczne do konstrukcji drugiej grupy mutantów. Analiza ich zachowania po przeniesieniu do komórek B. subtilis i wytworzeniu przetrwalników dostarczy danych do zaproponowania modelu opisującego funkcjonowanie receptora GerA w przetrwalnikach B. subtilis jak i uwzględnienia obserwowanego efektu tła genetycznego różnych szczepów laboratoryjnych.
Wpływ rezultatów
Poznanie mechanizmu działania receptora GerA przetrwalników B. subtilis będzie wkładem w badania nad tymi niezwykłymi formami komórki bakteryjnej. Mechanizm funkcjonowania receptorów kiełkowania wydaje się interesujący z kilku powodów: i) niezwykłości warunków panujących w dojrzałym przetrwalniku (zmniejszona ruchliwość składników błony komórkowej, brak ruchliwości białek); ii) stosunkowo niska zawartość wody na poziomie 30‐40%; iii) brak wykrywalnego metabolizmu; iv) zdolność do pozostawania w gotowości do kiełkowania przez bardzo długi okres czasu (dziesiątki lat). Wyjaśnienie mechanizmu działania receptora GerA Bacillus subtilis będzie miało również pośredni wpływ na prowadzone prace dotyczące przetrwalników wytwarzanych przez inne gatunki bakterii w tym gatunki patogenne.
Współpraca międzynarodowa
Prof. Peter Setlow jest światowym autorytetem w zakresie badań nad zachowaniem się przetrwalników B. subtilis. Posada on niemal 40-letnie doświadczenie w zakresie badań nad przetrwalnikami. Współpraca między laboratoriami została zapoczątkowana w roku 2012 prośbą o udostępnienie wytworzonego w Gdańsku szczepu pozbawionego fosfatazy PrpE wykazującego defekt kiełkowania w odpowiedzi na obecność L‐alaniny w środowisku. W 2013 miała miejsce krótka wizyta kierownika projektu w Famington, a w roku bieżącym 3 miesięczny wyjazd doktorantki z Gdańska do laboratorium prof. Setlow’a.